Natalie Portman ist das einzige Kind ihres israelischen Vaters, des Arztes Avner Hershlag, und ihrer jüdischen amerikanischen Mutter, geborene Shelley Stevens, die inzwischen als ihre Agentin arbeitet. Ihre jüdischen Großeltern wanderten in den 1930er-Jahren nach Israel aus - auf der Flucht vor dem Holocaust. Ihre Urgroßeltern kamen in Auschwitz ums Leben. Nachdem ihr Vater eine Anstellung in den USA gefunden hatte, zogen die Eltern mit der dreijährigen Tochter nach Maryland. In den folgenden Jahren wechselte die Familie, bedingt durch den Beruf des Vaters, mehrmals den Wohnort, unter anderem lebte die Familie in Washington (D.C.), New Haven und New York, wo Natalie Portman im Viertel SoHo, einem Stadtteil von Manhattan, eine Wohnung besitzt. Seit ihrem achten Lebensjahr ist Portman, die aufgrund ihrer zweisprachigen Erziehung fließend Englisch und Hebräisch spricht, aus moralischen Gründen Vegetarierin. Des Weiteren spricht sie Französisch, Deutsch, Spanisch, Japanisch und Arabisch.
Im Alter von elf Jahren wurde Portman in einer Pizzeria entdeckt. Man bot ihr später einen Job als Model für Revlon an, den sie mit Blick auf eine Schauspielkarriere ablehnte. Sie setzte sich unter 2.000 Bewerberinnen für die Rolle der Mathilda im 1994 erschienenen Léon – Der Profi durch. Portman spielte ein Waisenmädchen, das von einem Auftragskiller (gespielt von Jean Reno) aufgenommen wird und die den Tod ihrer Familie rächen will. Diese Hauptrolle war gleichzeitig ihr Durchbruch. Als erfolgreiche Jungschauspielerin spielte sie daraufhin unter anderem in Tim Burtons Mars Attacks! und in Woody Allens Musicalfilm Alle sagen – I love you und anderen Filmen mit. Für letzteren Film wurde sie für einen YoungStar Award nominiert. Um beim Theaterstück Das Tagebuch der Anne Frank am Broadway mitzuwirken, zog sie sich 1997 kurzzeitig vom Film zurück. Dafür sagte sie Robert Redford für eine Rolle in Der Pferdeflüsterer ab.

Ihre Rolle der Anne Frank gab sie im Mai 1998 wieder auf. Es folgte das unter der Regie Wayne Wangs entstandene Filmdrama Überall, nur nicht hier, in dem sie neben Susan Sarandon eine Rolle übernahm, für die sie 2000 für den Golden Globe als Beste Nebendarstellerin und den Young Artist Award nominiert wurde.

Eine ihrer bekanntesten Darstellungen konnte sie mit der Rolle der Padmé Amidala, der Frau des dunklen Jedi-Ritters Anakin Skywalker, in der international sehr erfolgreichen Star Wars-Filmreihe abliefern. Im Mai 1999 wurde der erste Teil, Star Wars: Episode I – Die dunkle Bedrohung, veröffentlicht. Die zwei anderen Teile folgten 2002 mit Star Wars: Episode II – Angriff der Klonkrieger und 2005 mit Star Wars: Episode III – Die Rache der Sith. Trotz dieser Erfolge schloss Portman die High School im Juni 1999 ab und nahm anschließend ein Psychologie-Studium an der Harvard University auf, das sie 2003 mit dem Bachelor abschloss.

Von Juni bis August 2001 war die Schauspielerin erneut am Theater zu sehen. Die Produktion Die Möwe, geschrieben von Anton Tschechow, in der auch Meryl Streep und Kevin Kline mitspielten, war ein Erfolg.

2005 erschien Mike Nichols' Film Hautnah, in dem sie eine junge Frau spielt, die ihren Platz im Leben sucht, neben Julia Roberts, Jude Law und Clive Owen. Für diesen Film gewann sie den Golden Globe und war bei der Oscarverleihung 2005 als Beste Nebendarstellerin nominiert. Ebenfalls 2005 mimte sie in der Rolle der aufgedrehten und unordentlichen Sam in der Independentproduktion Garden State und in der Hauptrolle in der Comicverfilmung V wie Vendetta. Für V wie Vendetta ließ sich Portman den Kopf kahlrasieren. 2008 besuchte sie die Berlinale, um ihren Film Die Schwester der Königin zu präsentieren.

2008 wurde Portman in die Wettbewerbsjury der 61. Filmfestspiele von Cannes berufen.

Für das deutsche Kino wird sie in den meisten Filmen von Manja Doering synchronisiert, die unter anderem auch Reese Witherspoon spricht.